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本试剂盒是含有gDNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒基于Histan II Reverse Transcriptase而开发。该酶热稳定性大幅度提高，可耐受高达50℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Histan II Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可扩增长达10kb的cDNA。

该试剂盒包含gDNA digester，可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物：Random Primers N6和oligo (dT)18，用户可根据需要，选择Random Primers N6，Oligo (dT)18或Gene Specific Primers作为逆转录引物，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。

• 5×Histan II Buffer plus包含gDNA digester抑制剂和dNTP。
  
• Histan II Enzyme Mix包含RNase inhibitor。
  
• 反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染。
  
• 建议RNA是溶于水而不是TE中，因为TE会干扰gDNA去除以及逆转录反应。
  
• 可以不经过基因组去除步骤，直接进行逆转录，这样所得到的结果与使用Histan II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（货号：SY0290）效果一致。但是请勿将gDNA digester与SY0290中的5×Histan II Buffer配套使用，因其不含终止gDNA去除反应的成分，会影响反转录和后续的qPCR实验。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo (dT)18，与真核生物mRNA的3'Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
  
• 原核生物RNA的反转录请选用Random Primers N6或者基因特异性引物。
  
• Random Primers N6适用性较广，适用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。
  
• 使用Random primers N6，进行2kb以下的cDNA合成时，Random primers N6的使用量为1～2μL；2kb以上的cDNA合成时，Random primers N6的使用量为0.4～1μL。

• 若实验需要去除残留基因组DNA
  
  • 在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2min。
    

    成分	用量
    RNase-free H2O	至10μL
    5×gDNA digester Buffer	2μL
    gDNA digester	1μL
    Total RNA 或mRNA	1ng～5μg* 或1ng～500ng*

    注^*：若后续实验为qPCR，Total RNA投入量为1ng～1μg；mRNA的投入量为1ng～100ng。若基因的表达丰度很低，最多可投入5μg Total RNA或500ng mRNA。
    
  • 反转录反应体系配制
    

    成分	用量
    RNase-free H2O	至20μL
    上一步的反应液	10μL
    5×Histan II Buffer plus	2μL*
    Histan II Enzyme Mix	2μL
    Random Primers N6 (50μM)	1μL
    Oligo (dT)18 (50μM) 或Gene Specific Primers (2μM)	1μL

    注：
    • 逆转录引物：荧光定量实验推荐Random Primers N6与Oligo (dT)18 1:1混合使用。
      
    • 5×Histan II Buffer plus加入量（^*）：因gDNA digester buffer的影响，本体系中只需要加2μL。
      
    • 建议先加入5×Histan II Buffer plus混匀后再添加反转录引物，以保证完全抑制gDNA digester的活性。
  • 反转录程序设置
    

    温度	时间
    25℃	5min
    42℃	30min
    85℃	5min

    注：反转录温度：推荐使用42℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将反转录温度提高到50℃。
    
  • 反转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。
• 若实验无需去除基因组DNA
  
  • 反转录反应体系配制
    

    成分	用量
    RNase-free H2O	至20μL
    Total RNA 或mRNA	1ng～5μg 或1ng～500ng
    5×Histan II Buffer plus	4μL*
    Oligo (dT)18 (50μM) 或Random Primers N6 (50μM)	1μL
    Histan II Enzyme Mix	2μL

    注：
    • 逆转录引物：荧光定量实验推荐Random Primers N6与Oligo (dT)18 1:1混合使用。
    • 5×Histan II Buffer plus加入量（^*）：因无gDNA digester buffer的影响，本体系中需要添加4μL。
      
    • 可选步骤：针对复杂模板，建议RNA、H2O、反转录引物在65℃保温5min后，冰上迅速冷却。然后再加入反转录酶和Buffer。
  • 逆转录程序设置参照上述基因组去除后的逆转录程序。